OverExpress C41(DE3)感受态细胞

储存条件：-70℃保存，避免反复冻融。不适合在液氮中保存。

OverExpress C41(DE3)菌株适用于毒性蛋白的表达，来源于BL21(DE3)菌株。OverExpress C41(DE3)是通过毒性蛋白在BL21(DE3) 内过表达筛选实验得到的基因突变菌株，该菌株的基因突变降低了T7 RNA聚合酶的酶活性，下调毒性蛋白的表达量使细胞存活。

OverExpress C41(DE3)菌株也可以表达常规蛋白，相同条件下，蛋白表达量略低于BL21(DE3)菌株。OverExpress C41(DE3)菌株属于 B菌株，lon和ompT蛋白酶缺陷型。OverExpress C41(DE3)感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率可达1× 107  cfu/μg    DNA。

基因型：F-ompThsdSB (rB-mB-) galdcm (DE3)

菌株抗性：对氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素和四环素敏感。

质粒转化步骤（以氨苄青霉素抗性的 pET 质粒为例）：

1.将感受态细胞置于冰水浴中化冻。待细胞刚化冻后，加入 1-5 μl 含有 1- 100 ng 的质粒 DNA 到细胞中，用手指拨打管底，轻 轻混匀。

2.冰水浴中放置 30 分钟，不要晃动。

3.42℃热击 60 秒钟，不要晃动。

4.冰水浴中放置 2 分钟，不要晃动。

5.加入 500 μl 的室温的 SOC 或 LB 培养基。

6.置于 37℃摇床中，150-200 rpm ，复苏培养 60 分钟。

7.取 50- 100 μl 菌液涂布在含有氨苄青霉素抗性的 LB 平板上。待液体吸干后，倒置平板 37℃培养 12-24 小时。

（平板划线分离法：复苏培养结束后，12000 rpm 离心 30 秒钟，弃掉上清，留 100 μl 左右的液体，用 200 μl 吸头轻轻吹打散菌块， 取 10 μl 重悬的菌液分多点滴在平板上，倾斜吸头，用吸头头部的侧面将滴在平板上的液体来回划线。这个方法可以获得更多更大 的单克隆菌落。）

1.挑取单菌落，接种到含 5 ml 带抗生素的 LB 培养基中。

2.37℃ , 200 rpm 震荡培养细菌至对数生长期（OD600=0.4-0.8）。

3.加入 IPTG 到终浓度为 0.4 mM ，37℃诱导 4 小时或 16℃诱导过夜。（可以设定不同浓度的 IPTG 来诱导表达。）

4.诱导完成后，离心收集菌体，用合适的方法（如考马斯亮蓝染胶法，Western-Blot法或酶活性分析法）分析菌体裂解物的总蛋 白、上清和沉淀组分，明确表达产物的表达状况（可溶性或不溶性表达）。

5.重组蛋白大量表达时，可用 10 ml 过夜培养物转接到 1 L 培养基中，当培养到 OD600=0.4-0.8 时，加入终浓度为 0.4 mM 的 IPTG， 37℃诱导 4 小时或 16℃诱导过夜（不同蛋白表达的 条件有所不同，需在实验中优化）。