Tuner(DE3)感受态细胞

储存条件：-70℃保存，避免反复冻融。不适合在液氮中保存。

Tuner(DE3)为 LacYZ 突变型 BL21(DE3)菌株。Tuner(DE3)菌株可利用 IPTG 的加入量来精准地控制重组蛋白的表达量，与 pET 系列载体联合使用，可以使得蛋白表达从低表达水平到高表达水平进行有效调控（使用低浓度的 IPTG 诱导重组蛋白低水平表达时， 目的蛋白可能会具有更好的可溶性和生物活性）。该菌株含有λ噬菌体 DE3 区，可以表达 T7 RNA 聚合酶。Tuner(DE3)菌株属于 B  菌株，lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型。Tuner(DE3)感受态细胞由特殊工艺制成，pUC19 质粒检测转化效率达 107cfu/μg DNA。

基因型：F-ompThsdSB (rB-mB-) galdcmlacY1 (DE3)

菌株抗性：对氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素和四环素敏感。

质粒转化步骤：（以氨苄青霉素抗性的 pET 质粒为例）

1.  将感受态细胞置于冰水浴中化冻。待细胞刚化冻后，加入 1-5μl 含有 1- 100ng 的质粒 DNA 到细胞中，用手指拨打管底，轻 轻混匀。

2.  冰水浴中放置 30 分钟，不要晃动。

3.  42℃热击 60 秒钟，不要晃动。

4.  冰水浴中放置 2 分钟，不要晃动。

5.  加入 500μl 的室温的 SOC 或 LB 培养基。

6.  置于 37℃摇床中，150-200rpm ，复苏培养 60 分钟。

7.  取 50- 100μl 菌液涂布在含有氨苄青霉素抗性的 LB 平板上。待液体吸干后，倒置平板 37℃培养 12-24 小时。

（平板划线分离法：复苏培养结束后，12000rpm 离心 30 秒钟，弃掉上清，留 100μl 左右的液体，用 200μl 吸头轻轻吹打散菌块， 取 10μl 重悬的菌液分多点滴在平板上，倾斜吸头，用吸头头部的侧面将滴在平板上的液体来回划线。这个方法可以获得更大的 单克隆菌落）。

1.  挑取单菌落，接种到含 5ml 带抗生素的 LB 培养基中。

2.  37℃ , 200rpm 震荡培养细菌至对数生长期（OD600=0.4-0.8）。

3.  加入 IPTG 到终浓度为 0.4mM ，37℃诱导 4 小时或 16℃诱导过夜。（可以设定不同浓度的 IPTG 来诱导表达）

4.  诱导完成后，离心收集菌体，用合适的方法（如考马斯亮蓝染胶法，Western-Blot法或酶活性分析法）分析菌体裂解物的总 蛋白、上清和沉淀组分，明确表达产物的表达状况（可溶性或不溶性表达）。

5.  重组蛋白大量表达时，可用 10ml 过夜培养物转接到 1L 培养基中，当培养到 OD600=0.4-0.8 时，加入终浓度为 0.4mM 的 IPTG， 37℃诱导 4 小时或 16℃诱导过夜（不同蛋白表达的 条件有所不同，需在实验中优化）。