W3110(DE3) 感受态细胞

储存条件：-70℃保存，避免反复冻融。

W3110(DE3)来源于 K-12 菌株， 细菌的染色体 DNA 上整合了 T7 RNA 聚合酶(T7RNP)表达框原件， T7RNP 位于 lacUV5  启 动子下，可表达 T7 RNA 聚合酶。 pET 、pGEX 、pMAL  等原核表达载体可使用该菌株进行外源重组蛋白的表达。 W3110(DE3)感 受态细胞由特殊工艺制作， pUC19 质粒检测转化效率大于 1×106cfu/μg DNA。

基因型: F-λ-rph-1INV(rrnD,rrnE)( lavUV5::T7 polymerase)

菌株抗性： 对氨苄青霉素、卡那霉素、壮观霉素、链霉素、庆大霉素和四环素敏感。

1.  将感受态细胞置于冰水浴中化冻。待细胞刚化冻后，加入质粒 DNA 或 5-10μl 连接产物到细胞中，用手指拨打管底，轻轻混匀； 2.  冰水浴中放置 30 分钟，不要晃动；

3. 42℃热击 60 秒钟，不要晃动；

4.  冰水浴中放置 2 分钟，不要晃动；

5.  加入 500μl 无菌的 SOC 或 LB 培养基；

6.  置于 37℃摇床中， 150-200rpm 震荡复苏培养 60 分钟；

7.  取 50-100μl 菌液涂布在含有抗性的 LB 平板上。待液体吸干后，倒置平板， 37℃培养 12-16 小时。

（平板划线分离法：复苏培养结束后， 12000rpm 离心 30 秒钟，弃掉上清， 留 100μl 左右的液体，用 200μl 吸头轻轻吹打散菌块， 取 10μl 重悬的菌液分多点滴在平板上，倾斜吸头，用吸头头部的侧面将滴在平板上的液体来回划线。这个方法可以获得更多更大 的单克隆菌落。）

（质粒快速转化步骤：将步骤 2 的时间缩短到 5 分钟， 对于氨苄青霉素抗性的质粒，步骤 4 完成后， 可直接涂布或划线于含氨苄青 霉素抗性的 LB 平板上。其它抗性的质粒仍需 60 分钟的复苏培养。）

1.挑取单菌落，接种到含 5ml 带抗生素的 LB 培养基中；

2.37℃ , 200rpm 震荡培养细菌至对数生长期（OD600=0.4-0.8）；

3.加入 IPTG 到终浓度为 0.4mM ，37℃诱导 2-4 小时或 16℃诱导过夜；

4.诱导完成后， 离心收集菌体， 用合适的方法（如考马斯亮蓝染胶法， Western-Blot 法或酶活性分析法） 分析菌体裂解物的总蛋白、 上清和沉淀组分，明确表达产物的表达状况（可溶性或不溶性表达）；

5.大量表达时，可用 10ml 过夜培养物转接到 1L 培养基中，当培养到 OD600=0.4-0.8 时，加入终浓度为 0.4mM 的 IPTG ，37℃诱导 2-4 小时或 16℃诱导过夜（不同蛋白表达的 条件有所不同，需在实验中优化。