产地 | 进口/国产 |
保存条件 | 低温冷藏 |
品牌 | 上海富雨 |
货号 | BC218-01 |
用途 | 科研 |
组织来源 | 见详情 |
细胞形态 | 见详情 |
是否是肿瘤细胞 | |
保质期 | 见详情 |
器官来源 | 见详情 |
免疫类型 | 见详情 |
品系 | 见详情 |
生长状态 | 见详情 |
物种来源 | 见详情 |
包装规格 | 20×100ul |
是否进口 | 是 |
ArcticExpress(DE3)感受态细胞
组成 |
BC218-01 |
ArcticExpress(DE3) |
20×100μl |
pUC19 质粒 |
5μl |
储存条件:-70℃保存,避免反复冻融。
ArcticExpress(DE3)细胞来源于 BL21-Gold 菌株,属于 Lon 和 OmpT 蛋白酶缺陷型的大肠杆菌 B 菌株。菌株含有庆大霉素抗性 的质粒能稳定表达海洋细菌 Oleispira antarctica 的两个低温分子伴侣 Cpn10 和 Cpn60。这些伴侣蛋白在较低温度(4-12℃)下,比 大肠杆菌 GroEL/GroES 表现出更高的活性, 在低温下可以更好地促进重组蛋白的正确折叠,潜在地增加了可溶性重组蛋白的产率和 活性,克服重组蛋白的错误折叠和不溶性。 该菌株又具备λ噬菌体 DE3 基因区, 可以表达 T7 RNA 聚合酶, 适用于含有 T7 启动子 的原核表达载体(如 pET 等)的高效表达。非 T7 启动子的表达载体(如 pGEX 、pMal ,pTrc 等载体)也可以在该菌株中表达。
ArcticExpress(DE3)感受态细胞由特殊工艺制成, pUC19 质粒检测转化效率大于 1× 107 cfu/μg DNA。
基因型:F– ompT hsdS(rB – mB –) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endAHte (cpn10 cpn60 Gentr )
菌株抗性: 具有庆大霉素、四环素抗性。对氨苄青霉素、卡那霉素、壮观霉素、链霉素、氯霉素敏感。
1.将感受态细胞置于冰水浴中化冻。待细胞刚化冻后,加入质粒 DNA 或 5-10μl 连接产物到细胞中,用手指拨打管底,轻轻混匀; 2.冰水浴中放置 30 分钟,不要晃动;
3.42℃热击 60 秒钟,不要晃动;
4.冰水浴中放置 2 分钟,不要晃动;
5.加入 500μl 无菌的 SOC 或 LB 培养基;
6.置于 37℃摇床中, 150-200rpm 震荡复苏培养 60 分钟;
7.取 50-100μl 菌液涂布在含有 20ug/ml 的庆大霉素和适当浓度的转化质粒的抗性抗生素的 LB 平板上。待液体吸干后,倒置平板, 37℃培养 12-16 小时。
(平板划线分离法:复苏培养结束后, 12000rpm 离心 30 秒钟,弃掉上清, 留 100μl 左右的液体,用 200μl 吸头轻轻吹打散菌块, 取 10μl 重悬的菌液分多点滴在平板上,倾斜吸头,用吸头头部的侧面将滴在平板上的液体来回划线。这个方法可以获得更多更大 的单克隆菌落。)
1.挑取单菌落,接种到含 5ml 带抗生素的 LB 培养基中;
2.37℃ , 200rpm 震荡培养细菌至对数生长期(OD600=0.4-0.8);
3.加入 IPTG 到终浓度为 0.4mM ,37℃诱导 2-4 小时或 16℃诱导过夜;
(低温诱导方法: 37℃ , 200rpm 震荡培养细菌到 1-2 个 OD 左右,然后将培养物降温至 10– 13°C,低温培养 15 分钟达到平衡, 将 IPTG 添加到摇瓶中,最终浓度达到为 0.1-0.5mM 之间。继续诱导培养 12-24 小时。)
4.诱导完成后,离心收集菌体,用合适的方法(如考马斯亮蓝染胶法,Western-Blot 法或酶活性分析法)分析菌体裂解物的总蛋白、 上清和沉淀组分,明确表达产物的表达状况(可溶性或不溶性表达);
5.大量表达时,可用 10ml 过夜培养物转接到 1L 培养基中,当培养到 OD600=0.4-0.8 时,加入终浓度为 0.4mM 的 IPTG ,37℃诱导 2-4 小时或 16℃诱导过夜(不同蛋白表达的 条件有所不同,需在实验中优化)