EHA105(pSoup)农杆菌感受态细胞

储存条件：-70℃保存，避免反复冻融。不适合在液氮中保存。

基因型：C58 (rifR) TipEHA105 (pTiBo542DT-DNA)（strepR ）SuccinamopinepSoup（tetR ）

农杆菌EHA105(pSoup)菌株由EHA105菌株改造而来，为C58型背景，核基因中含有利福平抗性筛选基因rif。此菌株携带一无自 身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) ，此质粒含有vir  基因（vir  基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件， pEHA105(pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。一些缺失农杆菌 复制相关元件（如pVS1的复制起点REP区或pVS1质粒的STA区）的表达质粒如pGreen、pGreenII-62SK和pGs2等不能在EHA105菌株 中繁殖。pSoup辅助质粒可以帮助这些不完整双元表达质粒在农杆菌中的复制。EHA105(pSoup)菌株具有四环素（Tet）抗性。

EHA105(pSoup)适用于水稻、烟草等植物的转基因操作。经植物表达质粒pGs2检测，转化效率可达103 cfu/μg ，-70℃保存12  个月转 化效率不发生改变。

转化方法：（采用冻融方法）

1.  取-70℃保存的EHA105(pSoup)农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化；

2.  无菌条件下，向感受态细胞中加入100ng- 1μg质粒DNA（ 次使用， 做一下预实验，确定所加质粒的 量），轻轻 混匀，冰水浴中静置5  分钟；

3.  将离心管置于液氮中速冻5分钟；（注：可用干冰和无水乙醇混合物代替液氮）

4.  然后快速将离心管置于37℃水浴中保持5分钟，不要晃动水面；

5.  将离心管放回冰水浴中，冰浴5分钟；

6.  无菌条件下加入800μl无抗生素的2xYT 、SOB 、SOC或LB液体培养基，于28℃振荡培养2-3小时，菌体复苏；

7. 6000rpm离心1分钟收菌，留100μl左右上清，轻轻吹打重悬菌体，取适量菌液，涂布于相应抗生素的LB平板上，于28℃培养 箱中倒置培养48-72小时。（实验表明当平板只含有50μg/ml的Kan时，28℃培养48h即可看到菌落；平板中含有50 μg/ml Kan 和20 μg/ml Rif  时，需28℃培养60h可看到菌落； 如果平板中含有50 μg/ml Kan和50 μg/ml Rif时则需要28℃培养72-90 h可看 到菌落）。

1.  加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/ 10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化 效率下降一个数量级。

2.  混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3.  平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。 4.  利福平浓度不应高于25 μg/ml ，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。

5.  培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长和筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入Ti  质粒筛选抗生素可防止Ti  质粒丢失， 但Ti  质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素，Ti  质粒丢失的概率极低(可以 忽略)。

6.  相关抗生素配制及工作浓度

利福平（Rif）用DMSO配制成20mg/ml的储存液，工作浓度为20μg/ml 。盐酸四环素（Tet）用甲醇溶解成10mg/ml的储存液， 工作浓度为10μg/ml 。硫酸卡那霉素（Kan）、硫酸链霉素（Strep）、硫酸庆大霉素（Gent）和羧苄青霉素钠盐（Carb）分别 用双蒸水配制成浓度为50mg/ml ，50mg/ml 、40mg/ml和50mg/ml的储存液，并用0.22μg滤器过滤除菌。工作浓度分别为

Kan:50μg/ml ，Strep:50μg/ml ，Gent:40μg/ml和Carb:50μg/ml。