GV3101 农杆菌感受态细胞

储存条件：-70 ℃ 保存，避免反复冻融。

C58 (rifR) TipMP90 (pTiC58DT-DNA) (gentR/strepR) Nopaline

GV3101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因Rif，为了便于转化操作，此菌株 携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90 (pTiC58DT-DNA) ，此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入 植物基因组必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元 载体T-DNA顺利转移）。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti  质粒含有筛选标签：Strep和Gent，赋予GV3101菌株链霉 素和庆大霉素抗性，适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作，经植物双元pCAMBIA2301质粒 检测，转化效率可达103 cfu/μg ，-70℃保存12个月转化效率不发生改变。

转化方法（采用冻融方法）：

1.  取-70℃保存的 GV3101 农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化；

2.  无菌条件下，向感受态细胞中加入 100ng- 1μg 质粒 DNA（ 次使用前 做预实验确定所加质粒的  量），轻轻混匀，冰水浴中静置 5 分钟；

3.  将离心管置于液氮中速冻 5 分钟；（注：也可以用干冰和无水乙醇混合物代替液氮）

4.  然后快速将离心管置于 37℃水浴中保持 5 分钟，不要晃动水面；

5.  将离心管放回冰水浴中，冰浴 5 分钟；

6.  无菌条件下加入 800μl 无抗生素的 2xYT 或 LB 液体培养基，于 28℃振荡培养 2~3 小时，菌体复苏；

7. 6000rpm 离心 1 分钟收菌，留 100μl 左右上清，轻轻吹打重悬菌体，取适量菌液，涂布于相应抗生素的

LB 平板上，于 28℃培养箱中倒置培养 48-72 小时。

（当平板只含有 50 μg/ml Kan 时，28℃培养 48 h 即可；平板中同时加入 50 μg/ml Kan，20 μg/ml Rif 时，需 28℃ 培养 60 h；如果使用的平板含有 50 μg/ml Rif 则需要 28℃培养 72-90 h）。

注意事项

1.  加入质粒时体积不应大于感受态体积的 1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降； 质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

2.  混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3.  平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应 减少质粒用量。

4.  利福平浓度不应高于 25 μg/ml ，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。

5.  培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入 Ti 质粒筛选抗生素 可防止 Ti 质粒丢失，但 Ti 质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑 这些抗生素，Ti 质粒丢失的概率极低(可以忽略)。