GV3101  农杆菌电转感受态细胞

储存条件：-70℃保存，避免反复冻融。

基因型：C58 (rifR) TipMP90 (pTiC58DT-DNA) (StrR/GentR), Nopaline type

GV3101菌株为农杆菌C58型背景，核基因中含有利福平抗性基因Rif。此菌株还携带一种自身转运功能丧 失的质粒(disarmed Ti plasmid)。GV3101菌株含有pMP90 (pTiC58DT-DNA)，该质粒含有vir基因（vir基因是TDNA 插入植物基因组所必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可辅助植物双 元表达载体的T-DNA的转移）。pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒还含有Str和Gent抗性基因，赋予GV3101菌株链 霉素和庆大霉素抗性。GV3101农杆菌适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。GV3101  电转

感受态特别适用于大质粒的转化，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率大于105 cfu/μg DNA。

1.  电极间距为0. 1cm的电转杯（Gene Pulser®/MicroPulser™ electroporation cuvettes）插入碎冰中，压实冰  面，冰中静置5分钟，使电转杯充分降温。（电转杯重复使用方法：每次用完后，用大量的自来水冲洗 干净去掉菌液和DNA ，用蒸馏水洗3遍，将其泡在75%乙醇中30分钟，取出杯子，沥干液体，放在超净

台中，使乙醇充分挥发，盖上盖子放干燥地方备用）

2.  取-70℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入10ng- 1μg质粒DNA（洗脱或溶解质粒的  溶液中离子不能太高，可用双蒸水稀释： 次使用前 做预实验确定所加质粒的 量），用手 拨打管底混匀，立即插入冰中，在超净台中用无菌吸头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上

杯盖，空管保留待用。

3.  启动电转仪，设置电击参数：C=25μF ，PC=200ohm ，V=2.4KV（此参数为BioRad公司推荐，依据不同 电转仪设置针对农杆菌合适的电击参数）。用纸巾擦掉电转杯外部的水分，将电转杯快速放入电转槽 中进行电击步骤。电击完成后，将电转杯快速插入冰中，加入700μl无抗生素的LB  并转移到原来保留

的感受态空管中，28℃ , 150-200rpm ，振荡培养2-3小时。

4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取200μl左右上清轻轻吹打重悬菌块，取100μl的菌液涂布于含相应抗生素 的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天（当平板只含有50 μg/ml Kan  时，28℃培养48小时 即可；平板中同时加入50 μg/ml Kan ，20μg/ml Rif时，需28℃培养60小时；如果使用的平板含有50 μg/ml

Rif则需要28℃培养72-90小时）。