一、实验步骤:
(1)样品制备:对于贴壁生长细胞,胰酶消化,调整细胞浓度约1×105/ml,滴加于盖玻片上(置于6孔板中),培养相应时间后,取出细胞爬片,用PBS 洗涤3次。
(2)样品固定:95%乙醇固定20min,PBS洗涤2次,每次1min。
(3)染核:苏木素染液染色2-3min,自来水洗涤。
(4)分色:镜下观察,若细胞核染色过深,用1%盐酸酒精溶液分色数秒,自来水洗涤。
(5)染胞质:浸入伊红染液染色1min,自来水洗涤。
(6)吹干或自然晾干细胞 爬片后,中性树胶封片。
若细胞用4%多聚甲醛固定,则染色时间相应延长,苏木素染色12-15min,伊红5min即可。
二、注意事项:
1、染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长,组织酸化而影响细胞核着色。因此,要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min,这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳,可在伊红溶液中滴加1-2滴冰cu酸。
2、切片染苏mu精后,分色这一步是关键,应在显微镜下控制进行,一般以细胞核染色清楚(晰)而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅,应重新染色后再行分色。
3、切片经酒精脱水后,入二甲ben时可出现白色不透明状态,此为脱水不彻底,应将切片退回无shui酒精,更换酒精、二甲ben,以求彻底脱水与透明。
4、在染色过程中不要让切片干燥,以免切片收缩、变形,影响神经元形态。
5、切片从二甲ben取出或进入二甲ben前,切片周边均应擦干净或吸干多余水分。
6、最后封固时,要用中性树脂,防止日后褪色,盖片要选大于组织块的面积,如漏出一部分不久将会褪色,所用树脂浓度要适当,树脂封固时不能有气泡。